Ключови съображения относно дизайна на протоколи за изследване за валидиране на вирусен клирънс на продукти за генна терапия

ICH Q5A(R2)-Фондация за международна хармонизация

ICH Q5A(R2) беше официално приет на 1 ноември 2023 г. и представлява основният международен документ с насоки за оценка на вирусната безопасност. В сравнение с Q5A(R1), публикуван през 1999 г., значителните актуализации във версията R2 включват: новодобавена глава за оценка на вирусната безопасност при непрекъснато производство (Глава 7); засилена роля на оценката на риска като основа на стратегиите за изчистване на вируса; включване на секвениране от следващо{10}}поколение (NGS) в съображенията за откриване на вируси; и изрични изисквания за оценка на нови продукти и производствени процеси. Q5A(R2) е приет от регулаторните органи, включително FDA, EMA и PMDA, предоставяйки унифицирана техническа рамка за валидиране на вирусно изчистване в световен мащаб.

NMPA-Китайска регулаторна система

Регулаторната рамка на NMPA за вирусна безопасност обхваща множество нива:

Ниво на документ	Име на документа	Година на издаване
Основополагащ документ	Технически насоки за премахване/инактивиране на вируси от кръвни продукти	2002
Основополагащ документ	Общи принципи за технически преглед на оценката за вирусна безопасност на продукти, получени от-биологични тъкани и продукти, експресирани-от еукариотни клетки	2005
Указание за-конкретни продукти	Технически насоки за фармацевтични изследвания и оценка на приложения за клинични изпитвания за рекомбинантен адено{0}}свързан вирус (rAAV) вектор-базиран in vivo продукти за генна терапия	2023
Указание за-конкретни продукти	Общи технически изисквания за фармацевтично качество на рекомбинантен адено{0}}свързан вирус (rAAV) вектор-базирани in vivo продукти за генна терапия за приложения за разрешение за търговия	2025
Иновативна насока	Технически насоки за валидиране на платформи на процеси за изчистване на вируси за приложения в клинични изпитвания на терапевтични рекомбинантни протеинови продукти (изпитване)a	2024

a: Тази насока представлява първият път, когато китайският регулаторен орган излага систематични технически изисквания за валидиране на платформата на процесите за изчистване на вируси и е в съответствие с духа на ICH Q5A(R2).

FDA и EMA{0}}Регулаторни изисквания на САЩ и Европа

FDA официално издаде документ с указания за индустрията, базиран на ICH Q5A(R2) през януари 2024 г. В допълнение, глава от Фармакопеята на САЩ (USP)<1050.1>предоставя допълнителни технически насоки за проектиране, оценка и характеризиране на процедури за изчистване на вируси. FDA организира симпозиум за вирусно изчистване на всеки две години; симпозиумът през 2023 г. разгледа авангардни-теми като нови модалности, непрекъснато производство, нови хроматографски среди и адсорбционни филтри. Основните насоки на EMA включват CPMP/BWP/268/95 (Бележка за насоки относно проучвания за валидиране на вируси: Дизайн, принос и интерпретация на проучвания, валидиращи инактивирането и премахването на вируси) и EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Ръководство за оценка на безопасността на вируси при биотехнологични изследвания Лекарствени продукти), като и двата са хармонизирани с ICH Q5A(R2).

Идентифициране на източници на вирусно заразяване

ICH Q5A(R2) подчертава, че дизайнът на валидирането на вирусния клирънс трябва да се основава на цялостна оценка на риска. За продуктите за генна терапия идентифицирането на източници на вирусно замърсяване трябва да се отнася до следните нива:

Ниво на клетъчна банка: Ендогенни вируси (напр. ретровирусни частици) и латентно инфекциозни вируси, потенциално съдържащи се в субстратите на производствените клетки (напр. HEK293, CHO, HeLa). Известно е, че клетките HEK293 съдържат ендогенни Ad5 E1 последователности и приблизително 900 bp EBV фрагмент и са способни да експресират репликационно-компетентен аденовирус; следователно трябва да се обърне специално внимание на този риск при оценката на риска.

Ниво на хелперен вирус: Производството на AAV вектор обикновено използва методи като тройна трансфекция с помощта на хелперни плазмиди, които носят риск от генериране на -компетентен за репликация аденовирус (RCA). По подобен начин опаковъчните клетки, използвани в производството на лентивирусен вектор, могат да генерират репликационен-компетентен лентивирус (RCL).

Ниво на суровини: Случайни вируси могат да бъдат въведени чрез суровини, използвани в производството, включително среди за клетъчни култури, фуражи и ензими. Този риск е особено значителен, когато се използват компоненти с-животински произход (напр. фетален говежди серум, разтвори за смилане на трипсин).

Разлики в риска: генна терапия срещу традиционни рекомбинантни протеини

Измерение на риска	Традиционни рекомбинантни протеинови продукти	Продукти за генна терапия
Вирусен източник	Ендогенни вируси от клетъчна банка; случайни вируси	вируси на клетъчни банки; помощни вируси; репликация-компетентни вектори (RCV/RCL); интеграция на генома на гостоприемника
Клетъчен субстрат	CHO, NS0, Sp2/0 и други добре-охарактеризирани клетъчни линии	HEK293, HeLa, CHO и др.; някои клетъчни линии са с туморогенен произход
Характеристики на продукта	Лекарство на-протеинова основа; добре-дефинирана структура	Вирусен вектор; създава рискове за биобезопасността
Стратегия за валидиране	Много{0}}етапно вирусно изчистване; акцент върху валидирането на стъпките на процеса	Изисква се откриване на RCV/RCL; валидирането и тестването са от съществено значение
Валидиране на платформата	Приложимо за установени процеси като S/D, ниско pH, нанофилтрация	Ограничена приложимост поради разнообразието от типове вектори

Таблица 1. Сравнение на рисковете за вирусна безопасност: продукти за генна терапия спрямо традиционни рекомбинантни протеинови продукти

Общи принципи

Изборът на индикаторен вирус е централен елемент в дизайна на протоколите за валидиране на вирусния клирънс. ICH Q5A(R2) изисква изборът на индикаторен вирус да се основава на оценката на риска и да се вземат предвид следните фактори:

Съответствие на вируса с производствения клетъчен субстрат (съответен вирус)

Физикохимични свойства на вируса (с обвивка/без{0}}обвивка, ДНК/РНК, диапазон на размера)

Устойчивост на вируса към физическо/химично третиране

Откриваемост и биобезопасност на вируса

За продуктите за генна терапия изборът на индикаторен вирус трябва допълнително да вземе предвид: ролята на самия векторен вирус като „релевантен вирус“; потенциалния риск от заразяване с помощен вирус; и изискванията за откриване и валидиране за репликационни-компетентни вируси (RCV/RCL).

Препоръчителен индикаторен панел за вируси

Вирус	Тип	плик	Геном	Размер (nm)	Обосновка на избора / Приложение
MVM	Парвовироза	Няма	едноверижен ДНК	18–26	Модел без{0}}плик; най-малък размер и най-висока устойчивост; подходящ за валидиране на нанофилтрация (като цяло не е приложимо за rAAV векторни продукти)
PPV	Парвовироза	Няма	едноверижен ДНК	18–26	Модел без{0}}плик; често използван индикаторен вирус за кръвни продукти
Рео-3	Реовирус	Няма	dsРНК	60–80	Модел без{0}}плик; среден размер; висока физическа стабилност
PRV	Херпесвируси	да	двойноверижна ДНК	150–200	Модел с плик; голям размер; широк набор от хостове
X-MuLV	Ретровирус	да	ssRNA	80–110	Модел на ретровирус с обвивка; подходящи за клетъчни субстрати, получени от CHO-
BVDV	Флавивириди	да	ssРНК	40–60	Модел с плик; използвани за оценка на методите за химическо инактивиране (сурогат на HCV)
VSV	Рабдовириди	да	ssRNA	70	Модел с плик; широка толерантност към pH; подходящ за валидиране на инактивиране с ниско{0}}рН

Таблица 2. Препоръчителен индикаторен панел за вируси за валидиране на вирусен клирънс на продукти за генна терапия

Специални съображения за AAV Vector продукти

За рекомбинантни AAV векторни продукти Техническите насоки на NMPA за фармацевтични изследвания и оценка на приложенията за клинични изпитвания за rAAV вектор-базирани in vivo продукти за генна терапия изискват внимание към откриването на -компетентен за репликация AAV (rcAAV). rcAAV се отнася до AAV, способен на автономна репликация, която обикновено възниква от хомоложна рекомбинация между помощния плазмид и продукта AAV геном. Откриването на rcAAV обикновено се извършва с помощта на инфекциозни анализи или qPCR методи, проведени отделно върху лекарственото вещество и пречистения продукт.

Струва си да се отбележи, че процесите на пречистване надолу по веригата за AAV векторни продукти обикновено включват нуклеазно смилане, хроматография (AEX), нанофилтрация и йонообменна хроматография (CEX/IEX). При традиционното валидиране на вирусния клирънс тези стъпки на процеса могат да доведат до значителни загуби на самия AAV вектор; следователно взаимодействието между векторните и индикаторните вируси трябва да се обмисли внимателно по време на проектирането-намаляващ модел. За определени стъпки на процеса (напр. нанофилтрация), където загубите на AAV вектор са значителни, трябва да се оцени дали корекциите на процеса са оправдани въз основа на данните за валидиране (напр. регулиране на размера на порите на нанофилтрационната мембрана).

Общи принципи

Мащабният{0}}модел (SDM) е основният инструмент за валидиране на вирусното изчистване; неговият дизайн трябва точно да представя ефективността на вирусното изчистване на производствения процес. ICH Q5A(R2), Раздел 6.2.2, изрично изисква мащабираният-модел да поддържа съгласуваност с производствения процес по ключови параметри. За продуктите за генна терапия следните съображения са особено важни при дизайна на SDM:

Представителност на критичните параметри на процеса

Умаленият-модел трябва да съответства на производствения процес по следните параметри: хроматографски условия (буферен състав, pH, проводимост); съотношение на натоварване (масово съотношение на вектор/супернатантен протеин); контактно време и температура; скорост на потока/време на престой; чистота и състав на продукта. За AAV продукти, ефектът от векторното разпределение на размера на частиците и съдържанието на празен капсид върху ефективността на нанофилтрацията също трябва да бъде специално разгледан.

Изисквания за квалификация на модела

ICH Q5A(R2) изисква адекватна квалификация на мащабния-модел, включително: сравнение на атрибутите на качеството на продукта (напр. чистота, възстановяване, плътност); квалификация на съгласуваността на критичните параметри на процеса; и гарантиране, че моделът-намаляване улавя променливостта на процеса на производство. За етапите на хроматография трябва да се квалифицира консистенцията на профила на пика, елуирането и промиването; за етапите на нанофилтрация трябва да се проверят ефектите от обемния капацитет и състава на продукта.

Формула за изчисляване на LRV

Стойността на логаритмично намаление (LRV) е основният показател за измерване на ефикасността на вирусния клирънс. ICH Q5A(R2), Раздел 6.5, предоставя подробно описание на методите за изчисляване на LRV и статистическа обработка. Основната формула за изчисление на LRV е: LRV=log₁₀(N₀/N), където N₀ е първоначалният вирусен титър след добавяне на вируса, а N е остатъчният вирусен титър след технологично третиране. Когато титърът на остатъчния вирус падне под границата на откриване на анализа, трябва да се използват методи за оценка като разпределението на Поасон (напр. тестване с голям-обем).

Приложение на доверителните интервали

Както ICH Q5A(R2), така и EMA CPMP/BWP/268/95 изискват оценка на доверителния интервал на резултатите от изчислението на LRV. Обикновено се прилага 95% доверителен интервал.

Критерии за ефективност

Съгласно техническите насоки на NMPA за премахване/дезактивиране на вируси от кръвни продукти, намаляване на вируса от По-голямо или равно на 4 лога показва, че стъпката на процеса е ефективна за премахване/дезактивиране на вируси. Въпреки това, този критерий не е абсолютен праг и трябва да бъде оценен по холистичен начин заедно с кривите на кинетиката на инактивиране, научната обосновка за избор на индикаторен вирус и цялостната надеждност на дизайна на протокола за валидиране. За продуктите за генна терапия трябва да се обърне специално внимание на кумулативния капацитет за изчистване през всички етапи на процеса, за да се гарантира, че общият профил на вирусна безопасност е на приемливо ниво.

Приложение и предизвикателства на нанофилтрацията

Вирус{0}}задържащата филтрация (нанофилтрация) е критична стъпка на вирусно изчистване при пречистване надолу по веригата на продукти за генна терапия. Типичните филтри за -задържане на вируси имат размер на порите приблизително 20 nm. Механизмът за изчистване на вируса при нанофилтрация е основно изключване, базирано на размер-и той може ефективно да премахне повечето вируси, по-големи от размера на порите на мембраната, включително малки парвовируси без-обвивка, като MVM и PPV.

Въпреки това, нанофилтрацията за продукти за генна терапия е изправена пред уникални предизвикателства: размерът на AAV векторите (приблизително 20–26 nm) е подобен на този на някои индикаторни вируси (напр. MVM, 18–26 nm), което може да доведе до намалено възстановяване на вектора; празните капсиди могат да повлияят на филтрационния поток и ефективността на задържане на вируси; вискозитетът на пробата може да се увеличи значително с концентрацията на вектора. Следователно дизайнът на SDM за валидиране на нанофилтрация трябва напълно да отчита ефектите от векторното разпределение на размера на частиците и съдържанието на празен капсид върху ефективността на филтриране и трябва да се обмисли използването на нанофилтрационни мембрани с по-големи размери на порите, както е подходящо.

Оценка на вирусния клирънс на хроматографските стъпки

Йонообменна хроматография (IEX) е основна стъпка в процесите на пречистване на продукти на AAV, като обикновено се използва нуклеазно смилане, последвано от анионобменна хроматография (AEX) за улавяне на празни и дефектни капсиди, или катионнообменна хроматография (CEX) за фино пречистване на пълни капсиди. Механизмите за изчистване на вируса в стъпките на хроматография включват изключване на размера, електростатични взаимодействия, афинитетни взаимодействия и други фактори. Дискусиите на симпозиума за вирусно изчистване на FDA 2023 подчертаха, че ефикасността на вирусното изчистване на стъпките на хроматография се влияе от множество фактори, включително капацитет на натоварване, рН, проводимост и цикъл на смола; трябва да се възприеме многофакторен ортогонален подход за цялостна оценка.

Контрол на вирусната безопасност в непрекъснатото производство

Новодобавената Глава 7 на ICH Q5A(R2) определя специфични изисквания за оценка на вирусната безопасност при непрекъснато производство. За продуктите за генна терапия непрекъснатото производство се превърна във важна посока на развитие, но също така въвежда нови предизвикателства за вирусна безопасност. Стратегиите за контрол на вирусната безопасност в непрекъснатото производство включват:-вградени филтри за защита от вируси като критични мерки за ограничаване; подходящо проектиране на времената на престой и процесните потоци; включване на стъпки на дезактивиране с определени времена на задържане; и разширено приложение на аналитична технология за процеси (PAT) за-наблюдение в реално време на критични параметри на процеса.